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Wells verbliebenen Zellen mit 0,5%igem Triton-X lysiert und mit einem Cell-Scraper aus den

Wells entfernt. Die Aktivität sowohl im Probenüberstand, als auch in den lysierten Zellen wurde

im Gamma-Counter ermittelt, so daß, ausgehend von der Gesamtaktivität des Ansatzes, der

Prozentsatz der auf den HUVECs adhärenten PMN errechnet werden konnte.

2.2.8. Analytik der Inositolphosphate

Phosphatidylinositole sind Bestandteile der Zellmembran. Sie dienen als "Second

Messenger", die Signale im Zellinneren weiterleiten, die an der Zellmembran, z.B. durch

Rezeptorbindung von Hormonen, entstehen. Dabei wird Phosphatidylbisphosphat der Zellmem-

bran zu Inositoltrisphosphat (IP

) hydrolysiert. Die Freisetzung der Inositolphosphate ist streng

an die Aktivität der Phospholipase C gebunden.

2.2.8.1. Prinzip der Methode

Die Messung der IP

-Freisetzung erfolgte nach der Methode von Berridge et al. (

Dazu wurden zunächst die Inositolphosphate der PMN mit [

H]-beladenem Inositol markiert.

Durch Stimulation der Zellen wurde die IP

-Freisetzung initiiert. Da IP

normalerweise bis zum

Inositol schrittweise dephosphoryliert wird, wurde das letzte Enzym dieser Abbausequenz, die

-Phosphatase mit Lithium-Ionen gehemmt. Auf diese Weise konnte eine Akkumulation der

Inositolphosphate im Cytoplasma erreicht werden. Nach Lyse der Zellmembranen wurde die

Lipidfraktion mit den in der Zellmembran verbliebenen Phosphatidylinositolen a/jointfilesconvert/444699/bgetrennt und

die Menge der freigesetzten Inositolphosphate in der wässrigen Phase des Cytoplasmas quantita-

tiv erfaßt (IP

= IP

+IP

2.2.8.2. Versuchsablauf

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