Mio pmn User Manual download pdf (Page 26)

PMN erneut zentrifugiert und anschließend in 600 µl Hanks/HEPES- Puffer (mit Calcium und

Magnesium) je 10 Mio. Zellen aufgenommen.

Die Reinheit der isolierten Granulozyten wurde in regelmäßigen Abständen durch

manuell durchgeführte Differentialblutbilder kontrolliert. Diese ergaben einen PMN-Anteil von

ca. 97%.

2.2.2. Vorbereitung und Inkubation der Endothelzellen

Die Endothelzellen wurden aus Umbilikalvenen nach der Methode von Jaffe et al. (

)

isoliert und als Monolayer auf 12- bzw. 24-Well Zellkulturplatten angezüchtet. Die Monolayer

wurden vor Versuchsbeginn mikroskopisch auf gleichmäßiges, dichtes Wachstum und Zellin-

tegrität geprüft. Anschließend wurde der Überstand des Nährmediums (Waymouth-Medium)

abgesaugt und die Zellen 2 mal mit je 1 ml Hanks/HEPES-Puffer pro Well gewaschen. Pro Well

wurde 1 ml Hanks/HEPES-Puffer vorgelegt und die Zellen - je nach Versuchsansatz - wahlweise

mit freier Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure in verschiedenen Konzentrationen beschickt.

Die Fütterung mit freier Fettsäure erfolgte 4 mal in 2 Stunden (Zeitpunkte 0, 30', 60', 90'). Die

Zellen wurden während dieser Zeit im Wasserbad bei 37°C aufbewahrt. Danach wurde der

Überstand abgesaugt und die Zellen erneut 2 mal mit je 1ml Hanks/HEPES-Puffer pro Well

gewaschen. Danach wurden 850 µl Hanks/HEPES-Puffer pro Well vorgelegt.

2.2.3. Versuchsprotokoll

Je Well wurden 150 µl der PMN-Suspension hinzugefügt, was einer PMN-Konzentration

von 2,5 Mio. Zellen pro Well entspricht. Der Ansatz wurde im Wasserbad bei 37°C zunächst für

15' aufbewahrt, um eine Sedimentation der PMN auf die Endothelzellschicht zu ermöglichen.

1 2 ... 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 ... 72 73

No comments

Mio pmn User Manual Page 26